出血性中风1号方对脑出血大鼠脑组织的影响

发布时间：2023-02-16　　浏览次数：599 次　　 　　来源：中国医药导报　　

      目的:研究出血性中风1号方对脑出血（ICH）大鼠脑组织的影响。方法选取84只雄性SD大鼠，体重（220±20）g，随机选取24只，采用随机数字表法将其分为空白组和假手术组（注射生理盐水），每组12只。剩余60只采用胶原酶Ⅶ注射诱导ICH模型，造模成功后采用随机数字表法将其分为模型组、脑血疏组（2.08ml/kg）及出血性中风1号方低、中、高剂量组（3.2、6.4、12.8g/kg）。空白组、假手术组、模型组灌胃等量生理盐水，其余组灌胃对应剂量药物，1次/d，连续7d。给药结束后，采用苏木精-伊红染色观察七组病理学变化；干湿重法测定七组脑含水量变化；采用酶联免疫吸附试验检测七组肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）水平，Westernblot检测核因子κB（NB-κB）p65及磷酸化NB-κBp65（p-NF-κBp65）水平。结果空白组、假手术组脑组织结构完整，模型组有大量红细胞及炎症细胞浸润，排列紊乱，水肿严重，出血性中风1号方低、中、高剂量组均有少量红细胞。空白组脑含水量、TNF-α、IL-6、p-NF-κBp65水平与假手术组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。模型组脑含水量、TNF-α、IL-6、p-NF-κBp65高于空白组（P＜0.05）。出血性中风1号方中、高剂量组脑含水量、TNF-α、IL-6、p-NF-κBp65低于模型组和出血性中风1号方低剂量组（P＜0.05）。出血性中风1号方低剂量组脑含水量、TNF-α、IL-6、p-NF-κBp65水平与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。出血性中风1号方中、高剂量组脑含水量、TNF-α、IL-6、p-NF-κBp65比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。各组NF-κBp65水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论中、高剂量的出血性中风1号方对ICH大鼠有脑保护作用，可能与抑制p-NF-κBp65、TNF-α、IL-6表达有关。

[基金项目]陕西省中医药管理局科研课题（2019-ZZ-LC020）。[作者简介]张洁（1993.6-），女，陕西中医药大学2019级中西医结合临床专业在读硕士研究生；研究方向：脑血管病的基础与临床研究。[通讯作者]王晓玲（1966.8-），女，硕士，主任医师，硕士生导师，陕西省中医局“中风病平肝活血”重点研究室主任；研究方向：脑血管病的基础与临床研究。

      脑出血（intracerebralhemorrhage，ICH）占卒中24%[1]，属中医“中风”范畴，急性期治法以熄风、化痰、活血为主，目前临床中尚无证据表明活血化瘀药会其增加出血风险[2]。出血性中风1号方有平肝熄风、凉血化瘀功效，有研究表明，该方对ICH患者有脑保护作用，但机制尚不明确[3-5]。本研究探讨该方对ICH模型大鼠脑组织的影响及机制。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物84只雄性SD大鼠，体重（220±20）g，购于成都达硕实验动物有限公司，许可证号：SCXK（川）2020-030，合格证号：0043162。本研究经过陕西中医药大学实验动物伦理委员会批准。1.1.2药物出血性中风1号方配方颗粒（水牛角15g、钩藤10g、牛膝10g、生大黄6g、栀子10g，广东一方制药有限公司，批号：9116533、9120933、9100363、9071391、9110873）。脑血疏口服液（山东沃华医药科技股份有限公司，批号：20070059）。1.1.3主要试剂与仪器胶原酶Ⅶ（sigma，批号：C824248）；肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-6试剂盒，核因子κB（nuclearfactor-κB，NF-κB）p65抗体（武汉博士德，批号：EK0526、EK0412、A00284-1）；磷酸化NF-κB（phosphorylatedNF-κB，p-NF-κB）p65抗体（Affinity，批号：AF2006）。脑立体定位仪（成都泰盟科技有限公司，DW2000），微量进样器（上海高鸽工贸有限公司，批号：HY20082702）。1.2研究方法1.2.1分组及给药84只大鼠中随机选取24只，采用随机数字表法将其分为空白组和假手术组，每组12只。剩余60只采用胶原酶Ⅶ注射诱导ICH模型，造模成功后采用随机数字表法将其分为模型组、脑血疏组（2.08ml/kg）及出血性中风1号方低、中、高剂量组（3.2、6.4、12.8g/kg）。空白组、假手术组、模型组灌胃等量生理盐水，其余组灌胃对应剂量药物，1次/d，连续7d。1.2.2模型制备参照文献[6-7]复制ICH模型：5%水合氯醛（6ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠，以前囟向后0.2mm，向右3.0mm，垂直下移5.5mm为注射点，微量进样器取1.5μl胶原酶Ⅶ注入右尾状核区。以Longa评分1～3分且取材观察到脑血肿为造模成功标准[8]。Longa评分标准[8]：无肢体活动不利记为0分，左侧肢体不能完全伸展记为1分，向左侧转圈记为2分，向左侧倾倒记为3分，不能自发行走记为4分。空白组不处理，假手术组注射等量生理盐水。1.2.3标本采集末次给药后麻醉，每组取3只心脏灌注后取脑用于苏木精-伊红染色；3只取右脑检测脑含水量；6只取脑血肿周围组织，-80℃冰箱保存。1.2.4苏木精-伊红染色观察病理学变化依次脱水、包埋、切片，苏木精-伊红染色，中性树脂封片，镜下观察，采集图像。1.2.5干湿重法测定脑含水量变化取右脑，滤纸吸干水分后称重记为湿重，然后置于80℃烤箱中干燥24h称重记为干重，脑含水量=（湿重-干重）/湿重×100%[9]。1.2.6酶联免疫吸附试验检测TNF-α、IL-6取脑组织，按酶联免疫吸附试验试剂盒说明操作，检测光密度（opticaldensity，OD）值（450nm处），计算TNF-α、IL-6浓度。1.2.7Westernblot检测NF-κB蛋白表达每组取4只的脑组织提取蛋白，SDS-PAGE电泳，转PVDF膜，封闭，加入一抗p-NF-κBp65（1∶800）、NF-κBp65（1∶1500）、β-actin（1∶10000，内参），4℃孵育过夜，加入二抗（1∶10000）室温孵育，显色，ImageJ处理图像，检测灰度值。1.3统计学方法采用SPSS19.0对所得数据进行统计学分析，正态分布的计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，比较采用t检验，多组计量资料比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。2结果2.1七组脑组织病理学结果空白组、假手术组脑组织结构完整，模型组有大量红细胞及炎症细胞浸润，排列紊乱，水肿严重，出血性中风1号方低、中、高剂量组均有少量红细胞。2.2七组脑含水量比较空白组、假手术组脑含水量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组脑含水量高于空白组，出血性中风1号方中、高剂量组脑含水量低于模型组和出血性中风1号方低剂量组（P＜0.05）。出血性中风1号方低剂量组、模型组脑含水量比较，出血性中风1号方中、高剂量组脑含水量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。.3七组脑组织TNF-α、IL-6水平比较空白组、假手术组TNF-α、IL-6比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组TNF-α、IL-6高于空白组，出血性中风1号方中、高剂量组TNF-α、IL-6低于模型组和出血性中风1号方低剂量组（P＜0.05）。出血性中风1号方低剂量组、模型组TNF-α、IL-6比较，出血性中风1号方中、高剂量组TNF-α、IL-6比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。2.4七组脑组织NF-κBp65及p-NF-κBp65水平比较各组NF-κBp65比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。空白组、假手术组p-NF-κBp65比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组p-NF-κBp65高于空白组，出血性中风1号方中、高剂量组p-NF-κBp65低于模型组和出血性中风1号方低剂量组（P＜0.05）。出血性中风1号方低剂量组、模型组p-NF-κBp65比较，出血性中风1号方中、高剂量组p-NF-κBp65比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

      讨论ICH是神经科急危重症，治疗以清除血肿，脱水降颅压及处理并发症为主[10]。ICH急性期以瘀血阻窍、风痰火炽证最常见，约占12.45%[11]。对ICH患者予以活血化瘀治疗能促进血肿吸收，改善神经功能缺损，降低致残率[12-13]。研究表明，瘀热病机主要由炎症引发[14]。出血性中风1号方中水牛角凉血止血为君药；钩藤熄风，大黄凉血逐瘀，合为臣药；佐以牛膝引火下行，栀子清热，共奏熄风清热化瘀功效。有研究表明，该方治疗ICH的靶点集中在抑制炎症和细胞凋亡[15]。脑水肿是ICH常见继发病理改变，严重影响ICH进展及预后[16-17]。本研究显示，出血性中风1号方中、高剂量组脑含水量低于模型组，提示该方能减轻脑水肿，与既往研究一致[18-19]。研究表明，NF-κBp65表达及TNF-α、IL-6水平与ICH病情及预后呈正相关[20-23]。NF-κB是由p65、p52、p50、RelB、c-Rel组成的转录调节因子家族，以同源或异源二聚体形式存在，参与调控炎症、凋亡等过程[24-25]。正常情况下，NF-κB与其抑制蛋白结合在细胞质中，处于非活化状态。ICH血肿作为致炎物质激活小胶质细胞，引发NF-κB抑制蛋白激酶被激活导致NF-κB被释放，后者与DNA上的κB位点结合，促进TNF-α、IL-6等炎症因子表达，加重继发性脑损伤[24,26-27]。本研究结果显示，出血性中风1号方中、高剂量组抑制p-NF-κBp65表达，降低TNF-α、IL-6水平，提示该方可下调TNF-α、IL-6等炎症因子的释放，进而抑制ICH的炎症损伤。综上所述，中、高剂量的出血性中风1号方对ICH大鼠有脑保护作用，可能与抑制p-NF-κBp65、TNF-α、IL-6表达相关。