自拟出血性中风1号方治疗脑出血作用靶点的筛选及其生物学功能分析

发布时间：2023-02-16　　浏览次数：866 次　　 　　来源：山东医药2021年　　

      目的：筛选自拟出血性中风1号方治疗脑出血作用靶点，并分析其生物学功能。方法首先在TCMSP、TCMID及化学专业数据库中收集自拟出血性中风1号方化学成分及作用靶点，利用OMIM、DisGeNET、GeneCards数据库获取与脑出血相关的靶点。利用R软件将自拟出血性中风1号方作用靶点与脑出血相关靶点取交集获取共同靶点（潜在作用靶点）；将所得到的共同靶点通过String平台进行蛋白质互相作用（PPI）筛选出自拟出血性中风1号方治疗脑出血的关键靶点。利用metascape数据库及R软件对自拟出血性中风1号方治疗脑出血的关键靶点进行生物学功能分析（GO及KEGG富集分析）。最后利用Pymol、AutoDockVina将自拟出血性中风1号方核心化学成分与关键靶点进行分子对接验证。结果共收集到自拟出血性中风1号方53种有效中药化学成分，124个药物作用靶点，1896个脑出血相关靶点，最终得到自拟出血性中风1号方治疗脑出血的潜在作用靶点71个。PPI筛选出的关键靶点包括JUN、TP53、AKT1、VEGFA等。GO共富集到1715个条目，主要涉及到氧化应激、细胞凋亡等方面；KEGG通路富集到130个条目，主要包括PI3K-AKT信号通路、P53信号通路、cAMP信号通路、NF-κB信号通路等。分子对接结果显示中风1号方核心化学成分与关键靶点结合能力较强。结论中风1号方治疗脑出血的作用靶点包括JUN、TP53、AKT1、VEGFA等，生物学功能主要是抑制炎症反应及细胞凋亡、降低氧化应激，相关信号通路主要有PI3K-AKT、P53、cAMP、NF-κB等信号通路。

      脑出血（ICH）为非外伤性脑实质内血管破裂出血，是一种潜在的破坏性神经损伤，脑出血患者占住院卒中患者的比例国内为18.8%～47.6%［1］，欧美为10%～15%［2］，具有致死率高、致残率高的特点。ICH的病理机制包括机械性损害导致的原发性损伤与血肿代谢产物的毒性反应、免疫损伤、氧化应激、炎症反应、神经细胞凋亡等引起的继发性损害［3］。ICH隶属于中医“中风”范畴，《黄帝内经》将其描述为“大怒则行气厥，而血菀于上，使人薄厥”。现代医家认为其病机为“脏腑功能失调，气血阴阳失衡导致气血逆乱，上冲于脑”。王平平等［4］研究发现在疾病急性期以风证、火证、痰证等标实证候为主。研究表明，中药可以通过调控体内炎症、氧化、凋亡、抑制血管痉挛和自噬等相关通路来减少血脑屏障破坏及脑组织水肿、抑制神经细胞凋亡、改善神经功能障碍，且这些中药的有效成分大多来源于清热药、理血药等［5］。出血性中风1号方为王晓玲主任医师多年临床经验方，主要由5味药物组成，方用水牛角清热凉血以宁血止血，钩藤平肝熄风、生大黄清热凉血止血，牛膝引火下行、栀子清热泻火，佐助水牛角清热凉血，佐助钩藤熄风降火，五药共奏平肝熄风、凉血止血之功效。在临床应用中疗效明显，能够促进患者神志转清、减轻神经功能缺损，且未发现有使血肿继续扩大及明显不良反应的发生［6-7］。现为进一步扩大临床应用，预测其可能作用机制，2020年3月2020年7月，我们采用网络药理学及分子对接技术对出血性中风1号方治疗ICH的作用靶点、生物功能、信号通路进行分析，预测其可能作用机制。

      1材料与方法1.1数据来源中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php），TCMID数据库及化学专业数据库（http：//www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp），UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/），OMIM数据库（OnlineMendelianInheritanceinMan，http：//omim.org/）、DisGenet数据库（http：//www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home）及GeneCards数据库，String数据库（https：//string-db.org/），metascape数据库（http：//metascape.org），PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）及RCSBPDB数据库（https：//www.rcsb.org/）。1.2出血性中风1号方化学成分及其作用靶点筛选在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）收集钩藤、牛膝、大黄、栀子4味中药的化学成分，并根据口服利用度（OB≥30%）、生物类药性（DL≥0.18）、血脑屏障（BBB≥-0.3）筛选出主要化学成分及其作用靶点。通过TCMID数据库及化学专业数据库［8］筛选出水牛角化学成分，对去重后的成分进行ADME（Absorption、Distribution、Metabolism、Excretion，毒药物动力学）筛选后获取主要成分及作用靶点。将获取的靶点名称在UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）中转换为对应的基因名。将最终得到的靶点信息进行整合，利用Cytoscape3.7.2软件以5味药筛选后的化学成分与标准化的基因名称为基础，形状大小按照Degree值设定，并将成分按照值大小依次排列绘制相关药物靶点网络图。1.3ICH相关靶点、出血性中风1号方作用靶点及其共同的靶点获取借助OMIM数据库（OnlineMendelianInheritanceinMan，http：//omim.org/）、Dis⁃Genet数据库（http：//www.disgenet.org/web/DisGeN⁃ET/menu/home）及GeneCards数据库，以“Cerebralhemorrhage”为检索词收集有关ICH的疾病靶点。因GeneCards数据库中靶点信息过多，根据经验，选择Score值大于中位数的值进行筛选，将三个数据库所得到的疾病靶点去重后的靶点与药物靶点通过R软件绘制韦恩图，获得自拟方治疗ICH的潜在作用靶点，并绘制疾病—成分—靶点网络图。1.4出血性中风1号方与ICH共同靶点的蛋白互作网络（PPI）构建将所获得的出血性中风1号方与ICH共同靶点输入String数据库（https：//stringdb.org/），选择MultipleProtein，物种限定为homosa⁃piens，将最低相互作用评分设置为高置信度（0.900）并隐藏游离节点，其余值保持默认设置，获得药物—疾病的PPI图，并导出TSV文件。1.5出血性中风1号方与ICH共同靶点的生物学功能分析将出血性中风1号方与ICH共同靶点导入metascape（http：//metascape.org）数据库，设置P<0.01，分析其主要的生物学过程与代谢通路，并将结果进行保存。将保存的数据信息通过R软件进行可视化分析。1.6出血性中风1号方核心化学成分与靶点蛋白的分子对接将筛选出的出血性中风1号方核心化学成分通过PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载2D结构的SDF文件，通过Chem⁃Bio3D将其转换为mol2格式的文件，并通过RCSBPDB数据库（https：//www.rcsb.org/）下载pdb格式的需要对接的靶点蛋白。蛋白筛选遵循：人源蛋白优先；分辨率越高越好；含配体结构且配体结构与所对接成分相似度高的优先。利用PyMol软件将靶点蛋白去除水分子后与原始配体进行分离后保存。最后将靶点蛋白、配体与核心化学成分导入到AutodockVina［9］软件中转换为pdbqt格式后进行分子对接。将PPI结果中前7个靶点基因及靶点—通路中排名前3的基因与排名前10的化学成分通过AutodockVina软件进行半柔性分子对接［10］，通过结合能（Af⁃finity）值来判断二者结合好坏，结合能小于0说明配体与受体可以自发结合，且值越小表示结合能越高，活性成分越容易与受体结合［11］。

      2结果2.1中风1号方化学成分与相关作用靶点初步获取方中五味药的化学成分有86种，经过ADME筛选并删除无靶点的成分后得到53种（包括大黄4种、钩藤27种、牛膝14种、栀子8种、水牛角1种），其中大黄、钩藤、牛膝、栀子重复成分为β-谷甾醇（beta-sitosterol），牛膝、栀子重复成分为豆甾醇（Stigmasterol），对应有效靶点865个，去重后保留124个单一靶点。药物—成分—靶点关系网络图见图1，其中β谷甾醇为大黄、钩藤、牛膝、栀子共同成分；豆甾醇为牛膝、栀子共同成分。该图中共有178个节点（包括药物5个，成分49个，靶点124个），1776条边。De⁃gree值排名前10位的成分分别是β-谷甾醇（140）、豆甾醇（58）、汉黄芩素（42）、黄芩素（34）、育亨宾（33）、methyl（E）-2-［（2S，3Z，12bS）-3-ethylidene-2，4，6，7，12，12b-hexahydro-1H-indolo［3，2-h］quinoli⁃zin-2-yl］-3-methoxyprop-2-enoate（30）、（E）-16，17-Didehydro-17-methoxy-17，18-seco-3-beta-yohimban16-carboxylicacidmethylester（28）、δ（sup18）-毛钩藤碱（28）、四氢鸭脚木碱（25）与coryincine（25）；靶点排名前10的分别是PTGS2（45）、PTGS1（36）、SCN5A（35）、AR（31）、KCNH2（29）、CHRM1（28）、CHRM3（26）、F10（26）、ADRA1B（24）与NCOA2（21）。2.2ICH与出血性中风1号方化学成分共同靶点三个疾病数据库靶点进行整合去重后得到ICH相关靶点1896个。出血性中风1号-ICH共同靶点71个。“疾病—成分—靶点”网络图见图2，共包括126个节点，838条边，Degree值排名前5的靶点分别是PTGS2（41）、PTGS1（32）、AR（31）、F10（26）与ACHE（18），化学成分排名前5的分别是汉黄芩素（29）、黄芩素（22）、β-谷甾醇（22）、育亨宾（17）与methyl（E）-2-［（2S，3Z，12bS）-3-ethylidene-2，4，6，7，12，12bhexahydro-1H-indolo［3，2-h］quinolizin-2-yl］-3-me⁃thoxyprop-2-enoate（16）。2.3出血性中风1号方治疗脑出血潜在作用靶点PPI图通过String数据库最终得到71个出血性中风1号方治疗ICH的潜在作用靶点的PPI图（图3），其中包括71个节点，183条边，平均度值为5.3。JUN、TP53、AKT1、VEGFA等基因出现频次最高，推测这些靶点可能为出血性中风1号方治疗ICH的潜在作用靶点。2.4出血性中风1号方治疗脑出血靶点的生物学功能分析结果最终得到1715条生物功能富集结果，其中1547条结果富集在生物过程（BP）中、50条结果富集在细胞成分（CC）中、118条结果富集在分子功能（MF）中，以P<0.01筛选前20条，得到20条BP结果，8条CC结果，20条MF结果，BP结果主要集中在毒性作用、氧化应激反应、生长调控、对脂多糖的反应、凋亡、对氧水平的反应等；CC主要集中在膜筏、谷氨酸能突触、线粒体外膜、RNA聚合酶Ⅱ转录因子复合物等方面；MF主要集中在蛋白激酶活性、铵离子结合、细胞因子受体结合、蛋白酶结合、核受体活性等方面；富集到KEGG通路上的结果有130条，根据P<0.01筛选前20条结果，与脑出血相关通路主要涉及到PI3K-AKT信号通路、P53信号通路、cAMP信号通路、NF-κB信号通路、炎症介质对TRP通路的调节等。2.5出血性中风1号方核心化学成分与靶点分子对接结果FOS与VEGFA的PDB结构未找到含有效配体的蛋白结构，故未进行分析。出血性中风1号方核心化学成分与靶点蛋白分子对接结果见表1。出血性中风1号方的主要化学成分与核心靶点对接均小于-5kcal/mol，结合图4可知，AK⁃TI与各成分对接结果较好，且与MOL000358结合性最强。

      3讨论ICH的发病机制尚不完善，目前关于其病理机制主要包括了早期血肿扩大对脑组织造成的原发性损伤，以及组织水肿、毒性物质释放、氧化应激、细胞凋亡等引起的继发性损伤［12］。目前对ICH的治疗也集中在降低原发性损伤，改善脑组织的继发性损伤上。出血性中风1号方各单味药物在临床应用与动物实验中疗效显著。研究表明水牛角可以通过缩短大鼠凝血酶原时间以及升高血小板数目来产生止血作用［13］；大黄能够促进脑出血患者神经康复，降低病理性损伤，抑制细胞凋亡，减轻脑组织水肿［14］；栀子具有减轻血脑屏障通透性［15］，抑制水通道蛋白4及基质金属蛋白酶9的表达［16］、增强抗氧化能力［17］、抑制NF-κB活化减少炎症因子释放［18］来减轻脑水肿，干预炎症反应，抑制神经细胞凋亡［19］的作用；钩藤能保护内皮细胞［20］，抗氧化、调节中枢神经及其受体、抑制炎症因子及其相关通路、抑制神经细胞凋亡、降低钙超载保护神经细胞［21］；牛膝可降低大鼠血压，保护神经元，改善卒中后神经症状［22］。通过这些单药所发挥的作用表现出中药治疗疾病的复杂性，为复方治疗ICH的药理作用提供依据，从侧面印证了其对ICH的治疗价值。网络药理学通过多层次、多靶标、多途径地对中药及其复方作用于人体的可能作用机理进行预测［23］，目前已广泛应用于药物作用机制研究、新药研发等方面，为中药发展提供了可靠的数据支撑［24-25］。分子对接［26］是基于配体与受体的锁钥原理，研究小分子配体与受体生物大分子的相互作用，寻找药物有效成分，以便从分子水平研究药物作用机制。本研究通过应用网络药理学从新的角度对出血性中风1号方治疗脑出血的的可能作用机制进行分析，在疾病—药物—靶点网络图中β-谷甾醇、汉黄芩素、黄芩苷等五种化合物靶点丰富，推测这些药物可能在治疗ICH中起到了重要作用，也表明了中药治疗疾病作用机制的复杂性。其中β-谷甾醇经研究发现能够缓解炎症［27］与氧化应激反应［28］；黄芩素能够抑制神经细胞凋亡［29］，维持血脑屏障的完整性［30］，并缓解氧化应激与炎症反应［31］；汉黄芩素能够调节氧化应激与炎症反应［32］；这三种有效成分作用机制主要集中在减轻氧化应激与炎症反应，抑制神经细胞凋亡等方面。其余2种化学成分尚未发现有明确抑制ICH损伤的作用机制，PPI互作网络所获得的关键靶点作用也集中在抑制炎症反应、促进神经保护、抑制细胞凋亡等。这些成分与靶点的分子对接结果也显示二者间结合能力较好，推测出复方的主要化学成分可能与这些关键靶点结合，通过减轻炎症反应与氧化应激、抑制细胞凋亡等ICH后的继发性损伤，从而起到脑保护的作用。GO分析发现出血性中风1号方对脑出血的治疗可能集中在毒性作用、氧化应激、凋亡等生物过程中；KEGG富集通路包括了PI3K-AKt信号通路、P53信号通路、NF-κB信号通路等；其中的PI3K-AKt信号通路在细胞增殖、分化、凋亡中发挥重要作用，ICH发生后激活PI3K与下游的Akt结合，使得Akt磷酸化，激活下游凋亡靶点引起细胞凋亡［33］。NF-κB作为PI3-AKT通路的下游蛋白，在炎症反应中发挥着重要的作用，是ICH继发性损伤的重要因子，可刺激TNF-α与IL-1β活化，而这些因子反过来再次激活NF-κB，使炎症反应放大［34］，加重脑组织损伤。根据以上研究，猜测出血性中风1号方中的药物有效成分可能作用于TNF、IL-6等炎症因子，降低胞质中的IKB蛋白降解，抑制NF-κB磷酸化表达，使其不能进入核内参与炎症反应，抑制其上游通路PI3-AKT激活，减缓炎症反应的发生，从而控制脑出血继发性损伤的发生。采用分子对接验证后发现，药物中的核心化学成分与靶点结合能力较好，这些靶点作用集中在炎症反应与细胞凋亡等方面。提示出血性中风1号方对脑出血的治疗可能集中在抑制炎症反应与细胞凋亡等方面。综上所述，通过运用网络药理学方法可以得出，出血性中风1号方可能是通过多靶点、多通路减少炎症反应、抑制细胞凋亡来降低ICH后的继发性损伤，从而达到临床治疗的目的。本次研究主要阐述了中药复方复杂性，为后期临床应用提供了数据支持，但因网络药理学所采用的数据库信息有不一样的实验条件，导致假阳性结果发生，并且已经评价过的成分与靶点信息及所检索的数据库数量有限，数据完整性与准确性有待提高，不能完全揭示其药理作用，具有一定的局限性［35-36］，因此预测的分子机制仍需通过后期动物与细胞实验进一步探索及验证。