“二至-芪灵”对恩替卡韦片治疗的慢性乙型肝炎IL-35及PD-1/PDL-1介导的免疫功能调节作用

发布时间：2020-10-10　　浏览次数：932 次　　 　　

“二至-芪灵”对恩替卡韦片治疗的慢性乙型肝炎IL-35及PD-1/PDL-1介导的免疫功能调节作用

程贤文¹ 施维群²   王峰¹  王振东¹

1.安康市中医医院 陕西安康 725000   2.浙江中医药大学 杭州 315000

摘要：目的：观察二至芪灵通过PD-1/PD-L1信号通路对慢性乙型肝炎免疫紊乱调节作用，探讨中医“阴阳平衡”和现代医学“免疫平衡”之间的内在联系。方法：选取90例慢性乙型肝炎患者，随机分为颗粒剂“二至芪灵”联合恩替卡韦治疗组（30例）和单用恩替卡韦的对照1组（30例）,汤剂联合恩替卡韦对照2组（30例），疗程48周，分别在基线、治疗第24周、48周检测外周血PD-1/PD-L1、IL-35频数及HBVDNA。结果：治疗48周后中药组PD-1/PDL-1表达水平显著低于单药恩替卡韦组二者有统计学意义；同期HBVDNA也持续降低较基线差异显著；而IL-35表达水平在这三者之间显示出一致的相关性,差异具有统计学意义。结论：二至-芪灵合剂可以通过调节负向免疫因子PD-1/PDL-1、IL-35等水平发挥免疫平衡再建作用。

关键词：乙型；肝炎；免疫；二至-芪灵；PD-1/PDL-1；IL-35

慢性乙型肝炎（CHB）呈世界流行，在我国CHB约有2000万例^[1]，由于目前乙肝病毒（HBV）仍难以被彻底清除，反复的炎症活动、肝细胞坏死及肝纤维化，导致肝硬化、肝功能衰竭、甚至肝癌，严重危害患者生活质量和生存时间，是全球重大的公共卫生健康问题。在HBV持续感染过程中，CD4+、CD8+T细胞表达的PD-1/PD-L1及IL-35等抑制性细胞免疫持续活跃。在当下研究领域中正向免疫调控十分丰富，而中医药干预的负向免疫调控尚属不多，本研究就中药二至-芪灵合剂对恩替卡韦片治疗的慢性乙型肝炎PD-1/PDL-1介导的免疫功能调节作用做如下报道。

1. 资料和方法

1.1研究对象: 收集2018年1月至2019年1月安康市中医医院消化内科门诊及住院CHB患者90例，纳入标准均参考2015年中国慢性乙型肝炎防治指南的诊断

标准和抗病毒适应症标准。将90例患者采用随机、对照设计方案，按随机数字表分为颗粒剂“二至芪灵”联合恩替卡韦治疗组和单用恩替卡韦的对照1组，汤剂联合恩替卡韦对照2组。所有符合纳入标准的患者在性别、年龄、病程等基线一致（P>0.05）。所有患者排除6个月内有干扰素、核苷（酸）类药物抗病毒治疗或免疫调节治疗；排除合并其他肝炎病毒感染（HAV、HCV、HDV、HEV、HIV）；排除失代偿期肝硬化、原发性肝癌、自身免疫性肝病、酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、妊娠和哺乳期妇女；精神疾患、肾功能异常和严重器质性疾病者。中医纳入标准：由两位副主任以上中医师综合四诊资料辨证符合“阴阳失衡”基本证型，偏阴虚满足A+B，偏阳虚满足C+D：A 消瘦、干燥、便秘、喜冷饮，或五心烦热、骨蒸潮热、盗汗，或头晕目眩等；B 舌红苔少，或舌小苔干，或脉细数；C 面色晄白、畏寒肢、喜热饮，或脘腹冷痛、喜静蜷卧，或小便清长、下利清谷乏力等；D 舌淡、舌嫩胖、苔白，或苔水滑舌边齿痕，或脉细微或沉或沉迟等。

1.2 治疗方法: 治疗组采用恩替卡韦片联合颗粒剂“二至-芪灵”，对照1组单用恩替卡韦，对照2组采用恩替卡韦片联合汤剂“二至-芪灵”治疗。中药每日一剂，分早晚两次口服；恩替卡韦，0.5mg，每日一次，口服（恩替卡韦，批号：H20100141，0.5mg/片）。“二至-芪灵”由中药颗粒剂女贞子 旱莲草 黄芪 仙灵脾四味中草药组成，颗粒剂剂量：偏阴虚30g、30g、5g、5g，偏阳虚5g、5g、30g、30g，中药每日一剂，每剂分两等份，一次开水冲服100ml，早晚两次分服，饭前或饭后间隔30分钟。中药汤剂成分剂量同颗粒剂，由我院中药房统一备置，每日一剂，加饮用水800ml，武火煮开锅后，文火煎煮40分钟，液体包装机灌装150ml／袋，一日两袋，空腹或餐后1小时口服，质保期限：常温7天，4℃以下14天。

1.3 观察及检测指标：分别在基线、治疗第24周、48周检测外周血PD-1/PD-L1、IL-35频数及HBVDNA。外周血 PD-1/PD-L1检测：3支流式管，分别加入抗人 CD4-FITC抗体10μl和MouseIgG1-PE同型质控2.5μl、抗人 CD4-FITC抗体10μl和抗PD-1-PE抗体2.5μl、抗人CD4-FITC抗体10μl和抗人B7-H1-PE抗体2.5μl，然后每管各加入全血50μl，混匀，避光15min后加入1ml溶血剂，室温放置10min，1500r离心，5min弃上清，再分别加入lml生理盐水，混匀，1500r离心，5min 弃上清，最后加入500μl -1ml生理盐水重悬细胞，上流式细胞仪检测。采用FS-SS 参数分析基础上，对全PBMC设门，设定 CD4+细胞门，检测CD4+T细胞上PD1/PD-L1的表达水平，并扣除同型对照的非特异性本底值。IL-35检测：采取ELISA法检测外周血IL-35水平，按照稀释加样，温育加酶，陪洗洗涤，加酶温育，洗涤显色，加终止液测定的程序执行。HBVDNA采用PCR检测。

1.4.统计学方法：所有计量资料以均数±标准差(`C±S)表示。每组与基线比较采用配对t检验；组间比较对治疗前后差值采用独立样本t检验。总疗效符合正态分布采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。对数据进行整理核查后，运用SPSS21.0统计软件进行数据分析。

2.结果 

2.1治疗组和对照组PD-1 表达水平比较，见（表1）

表1  治疗组和对照组PD-1 表达水平比较(%)

注：组内与治疗前比较，*P<0.05；组间同期比较，△P<0.05

2.2 治疗组和对照组PD-L1 表达水平比较，见（表2）

表2 治疗组和对照组外周血PD-L1表达水平比较(%)

注：与本组24周比较，*P<0.05；与本组治疗前比较，△P<0.05

2.3各组HBV-DNA（log10IU/ml）比较，（见表3）

表3两组治疗前后HBsAg、HBV DNA（log10IU/ml）比较，(`C±S)。

注：与基线比较，△P＜0.05；与对照组同期比较，*P＜0.05

2.4两组治疗前后IL-35表达的比较，（见表4）

表4 两组治疗前后IL-35（pg/ml）表达的比较，(`C±S)

组别	基线	24周	48周
治疗组	70.57±15.85	62.56±12.74	49.35±8.24*△
对照1组	69.86±15.28	67.73±13.72	64.67±12.64
对照2组	71.28±17.84	63.82±11.43	51.53±8.65*△
t值	0.17	1.32	5.56
P值	>0.05	>0.05	0.02

注：与基线比较，*P＜0.05；与对照组同期比较，△P＜0.05

3.讨论

慢性乙型肝炎当下面临有抗病毒药如何彻底清除乙肝病毒，免疫平衡的持续性，纤维化的逆转等核心问题。这三者有一方面得到解决，基本可以把乙肝和丙肝治疗同日而语，免疫清除和耐受功能是整个病程最中心的环节。在中医“阴阳平衡”指导思想下，我们通过对照研究发现中药“二至-芪灵合剂”对慢乙肝患者机体免疫的平衡再建有一定调节作用。

在CHB患者外周血中Th1细胞分泌的IL-2、TFN、IFN-γ明显不足，而Th2细胞分泌的IL-10、IL-14等显著增多，细胞毒性T细胞活化水平低，导致HBV清除受限而持续感染^[2]。研究发现自然调节性T细胞（nature T cell,nTreg）和辅助性T细胞17（Th17）在CHB慢性炎症和纤维化中起决定作用^[3]。IL-35^[4]是由αN3βp35亚基组成的异源性二聚体，是近年发现的IL-12家族的一个新成员，主要表达于CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞，也可促进其分化，同时IL-35抑制CD4+和CD8+细胞，在CHB中导致效应T细胞功能耗竭，炎症持续慢性化发展。研究发现^[5]，IL-35可抑制TH17细胞增值和分化，并抑制分泌IL-17及IL-22水平，从而抑制炎症反应。同时程序性死亡1（Pro-grammed death-1，PD-1）及程序性死亡配体1（Programmed death-1 ligand1，PD-L1），是近年来慢乙肝免疫研究领域的热点^[6-7]。PD-1表达于活化的T细胞表面，与PD-L1结合发挥抑制T细胞、B增殖，抑制IL-2等细胞因子及免疫球蛋白的分泌，亦通过IL-35等促进CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞增值，在CHB整个病程中，PD-1/PD-L1的表达水平与HBVDNA 载量、肝脏炎症及纤维化程度等方面密切相关^[8]。

本项目研究发现中药“二至-芪灵”治疗的CHB患者外周血PD-1表达水平治疗48周后明显低于单药恩替卡韦对照组，同期患者HBVDNA载量持续降低，治疗48周后均低于检测下限值，而PD-1的配体PD-L1表达亦显著下降差异有统计学意义。对照组虽然病毒载量较基线明显下降，但仍有少数病例病毒未达到检测下限，这跟其外周血高表达PD-1/PD-L1水平抑制机体免疫清除功能有一定的关联。结果表明PD-1/PD-L1表达水平与CHB持续感染和HBV病毒清除密切相关。本研究同时也从小数据证实中药颗粒剂与汤药临床疗效相当。

本研究还发现，被乙肝病毒感染而未行抗病毒治疗时，患者体内IL-35呈现高表达状态，而抗病毒治疗后，机体IL-35水平均分泌持续减少。有所不同时的是，中药“二至-芪灵”干预后IL-35水平更低于恩替卡韦对照组。而在Okada K的研究中发现^[9]，IL-35可抑制CD4+T细胞活性，降低TH17细胞分泌IL-17而导致牙周病的慢性炎症发生。不难联想到，在慢乙肝患者中IL-35抑制TH17细胞以及CD4+T细胞等降低了其表达PD-1水平使得抗病毒疗效受到影响。但IL-35以及PD-1/PD-L1之间调节免疫平衡精密机制仍有待进一步深入探讨。

总之调节负向免疫细胞、细胞因子及分子的表达水平，如IL-35、PD-1/PD-L1等，对免疫清除和耐受发挥重要的调节作用,研究发现其在肺癌、胃癌、胶质瘤等肿瘤患者的诊治中已初显成效^[10-11]，在CHB患者中通过中药调节人体阴阳之平衡，使得免疫抑制在一定范围内既可抑制炎症反应又可清除乙肝病毒复制，对慢乙肝患者达到最有效的治疗。当然攻克免疫平衡持续再建之一难题仍需医学界的同仁们共同努力，这既是CHB面临治疗的困境，亦是较有前景性的靶位。

参考文献(略)